تعريف الفطريات باستخدام التقنيات بدون جيل للتعريف الجزيئى لاهم الفطريات المفرزة للسموم Lamp & PCR
الموسم العلمى 2011- 2012
اللقاء العلمى الثالث
د. كامل احمد عبد السلام
باحث اول
قسم أمراض القطن ونباتات الالياف
مقدمــة :
السموم الفطرية عبارة عن نواتج أيضية تنتج بواسطة الفطريات الخيطية و التي لها آثار سامة واضحة علي الفقاريات و ذلك عندما يتم إعطاؤها بجرعات صغيرة بطريقة طبيعية. و من أجل المحافظة على الأمن الغذائي و حماية المستهلكين من الملوثات الضارة يجب فحص المحاصيل الزراعية خلال مراحل الإنتاج المختلفة لوجود الفطريات ، و قد أستخدم تفاعل البلمرة المتسلسل كأداة تشخيصية بديلة للطرق الميكروبيولوجيـــــــة و الكيميائية التقليدية التي تستخدم في تحديـــــــــــد و تعريف أخطر الأنواع المنتجة للسموم في أجناس الفيوزاريوم ، الأسبرجيليوس و البنسيلليوم، و من طرق التفاعل المتسلسل التي تم استخدامها فى العقد الأخير منذ أول وصف لاستخدام هذه التقنية في تحديد الجينات المسؤله عن الافلاتوكسينات في الأسبرجيليوس فلافس A. flavus. .
تقنية التفاعل المتسلسل:
Polymerase Chain Reaction (PCR)
منـــذ أن اكتشف كلآ من د/فرانسيز كريك Francis Crick و جيمس واتسون James Watson تركيب الـ د ن ا DNA اللولبي المزدوج منذ خمسين عاما مضت و قد حدثت العديد من التطورات بناء علي الطبيعة الحيوية ، الفيزيائيــــة و الكيميائية للحمض النووي DNA. و الطفرة التي حدثت في مجال تقنية البيولوجية الجزيئية ادت إلي مرحلة جديدة في تعريف الفطريات و البكتريـــــا ، و عرفت هذه التقنية الحديثة بتفاعل البلمرة المتسلسل PCRو هي تقنية مبنية علي أساس الحمض النووي . كل فطر له بصمة جينية فريدة تميزه من بين جميع الأنواع . و تتمثل قوة تفاعل البلمرة المتسلسل في القدرة علي تضخيم التتابع المختار من البصمة الجينية إلي الحد الذي يمكن من خلاله تعريفها و تحديدها بسهولة .
التقنيات الغيرمعتمدة على جيل
<!--تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي:
Quantitative PCR (Q-PCR)
و في مقدمة تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل توجد طريقة تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي quantitative PCR (QPCR) و التي تستخدم حاليا في المختبرات و في هذا النظام يتم إضافة مجس فلوروجيني خاص fluorogenic probe إلي عملية التضخيم في تفــــاعل البلمـرة المتسلسل و عند إطلاق هذا المجس يحدث التفاعل و يصدر الإشعاع , حيث يمكن تحديد و قياس مستويات الضوء الفلورسينتي المتراكم في نفس الوقت . هذا المجس الفلوروجيني تم تصميمه ليتحد فقط مع التتابع المختار من البصمة و من هنا يمدنا بتخصصية عالية في التحديد. و مع تطور تقنية تفـــاعل البلمــــرة المتسلســـل المسمـــــاة cutting-edge PCR، أصبح ممكناً التحديد الكمي السريع و الدقيق لأي ملوث فطرى و بكتيري في العينات بصرف النظر عن حيويتها.
مزايا التعريف بتقنية تفاعل البلمرة المتسلسل :
تتميز تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل باختصار الوقت مقارنة بالتقنيات الأخرى مثل الزراعة علي الأوساط المغذية و التحليل الميكروسكوبي، بالإضافة إلي كونها تتميز بالدقة والحساسية.
ومن أهم مايميز تفاعل البلمرة المتسلسل الكمى أنها:
<!--تساهم فى اختصار وقت turnaround time التعريف او التشخيص الى حوالي 2-8 ساعات
<!--التعرف الدقيق علي الفطريات والمسببات المرضية.
<!--نتائج يمكن أعادة إنتاجها عند التكرار.
<!--الحصول علي نتائج كمية و كيفية .
<!--تشخيص ممتازمن خلال التخصصية والحساسية العالية .
<!--تقنية لامب:
Loop mediated isothermal AMPlification (LAMP)
هى تقنية تعتمد على احداث تضاعف للحامض النووى DNA or RNA فى انبوبة مفردة من خلال اربعة بوادى متخصصة يتم تصميمها طبقا لنوع المسبب المرضى ونظرا لانخفاض تكلفتها وعدم احتياجها الى اجهزة معقدة مثل جهاز التدوير الحرارى فهى تستخدم لتشخيص المسببات المرضية الهامة.
تم تطوير هذة الطريقة فى العام 2000 باليابان واستخدمت فى تشخيص العديد من الامراض المعدية التى تصيب الانسان ومنها الدرن وكانت اول الابحاث التى نشرت فى مجال تعريف وتشخيص مسببات امراض النبات فى العام 2010 والعام 2011.
يمكن قياس وتعريف منتج التضاعف ضوئيا من خلال درجة التعكير الناشئة عن زيادة كمية بيروفوسفات الماغنسيوم فى محلول التفاعل او عن طريق اضافة بعض الصبغات الفلورسنتية وهذا التغير اللونى لا يحتاج الى اجهزة لقياسة ويمكن التعرف علية من خلال الرؤية بالعين.
ومن أهم ما يميز تقنية لامب أنها :
<!--غير مكلفة حيث لاتحتاج الى اجهزة عالية الثمن لعمل التضاعف.
<!--سريعة حيث تستعرق عدة ساعات.
<!--المدى الحرارى المستخدم للتضاعف واحد 63 درجة مئوية.
<!--شديدة الحساسية ويمكن التعرف على النتائج من دون اجهزة قياس.
اهم تطبيقات الاختبار الكمي الغير معتمد على جيل فى مجال امراض النبات :
<!--تعريف وتشخيص المسببات المرضية الهامة وخصوصا الحجرية منها.
<!--تعريف وتشخيص الفطريات المفرزة للسموم.
<!--التقدير الكمى للمسببات المرضية داخل العائل وبالتالى يمكن استخدامها للتعرف على وبائية المرض.
Literature cited
Abd-Elsalam K. , Bahkali A., Moslem M., Amin O., Niessen L. (2011) An optimized protocol for DNA extraction from wheat seeds and loop-mediated isothermal amplification (LAMP) to detect Fusarium graminearum contamination of wheat grain. International Journal of Molecular Sciences. 12:3459-3472. (IF: 2.279).
Niessen, L.; Vogel, R.F. (2010) Detection of Fusarium graminearum DNA using a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay. International Journal of Food Microbiology140, 183–191. (IF: 3.01)
والله ولى التوفيق،،،
ساحة النقاش